馬Ⅱ型前膠原氨基端原肽(PⅡNT)檢測試劑盒

使用說明書

馬Ⅱ型前膠原氨基端原肽(PⅡNT)檢測試劑盒檢測原理:

本試劑盒采用雙抗體夾心法：抗馬Ⅱ型前膠原氨基端原肽(PⅡNT)單抗包被于酶標板上，標本和標準品中的Ⅱ型前膠原氨基端原肽(PⅡNT)會與單抗結合，游離的成份被洗去。加入酶標抗體，抗馬Ⅱ型前膠原氨基端原肽(PⅡNT)抗體與結合在單抗上的馬Ⅱ型前膠原氨基端原肽(PⅡNT)結合而形成**復合物，游離的成分被洗去。加入顯色底物，若反應孔中有Ⅱ型前膠原氨基端原肽(PⅡNT)，辣根過氧化物酶會使無色的顯色劑現(xiàn)藍色，加終止液變黃。在450nm處測OD值，Ⅱ型前膠原氨基端原肽(PⅡNT)濃度與OD450值之間呈正比，可通過繪制標準曲線求出標本中的Ⅱ型前膠原氨基端原肽(PⅡNT)濃度。

選用世界有名生產(chǎn)廠家的原料，采用專業(yè)體外診斷試劑生產(chǎn)技術制造。適用于體外定量檢測馬血清、血漿或細胞培養(yǎng)上清液中天然重組馬Ⅱ型前膠原氨基端原肽(PⅡNT)濃度。僅供科研使用，使用前請仔細閱讀說明書并檢查試劑組分。

馬Ⅱ型前膠原氨基端原肽(PⅡNT)檢測試劑盒組成：

相關試劑在分裝時會比標簽上標明的體積稍多一些，請在使用時量取而非直接倒出！

馬Ⅱ型前膠原氨基端原肽(PⅡNT)檢測試劑盒樣品收集:

1. 血清：全血樣品于室溫放置2小時或4℃過夜后于1000×g離心20分鐘，取上清即可檢測，收集血液的試管應為一次性的無熱原，無內**試管。

2. 血漿：抗凝劑推薦使用EDTA-Na2，樣品采集后30分鐘內于1000×g離心15分鐘，取上清即可檢測。避免使用溶血，高血脂樣品。

3. 組織勻漿：用預冷的PBS (0.01M, pH=7.4)沖洗組織，去除殘留血液（勻漿中裂解的紅細胞會

影響測量結果），稱重后將組織剪碎。將剪碎的組織與對應體積的PBS（一般按1:9的重量體積比，比如1g的組織樣品對應9mL的PBS，具體體積可根據(jù)實驗需要適當調整，并做好記錄。推薦在PBS中加入蛋白酶抑制劑）加入玻璃勻漿器中，于冰上充分研磨。為了進一步裂解組織細胞，可以對勻漿液進行超聲破碎，或反復凍融。*后將勻漿液于5000×g離心5~10分鐘，取上清檢測。

4. 細胞培養(yǎng)上清：取細胞培養(yǎng)上清于1000×g離心20分鐘，除去雜質及細胞碎片。取上清檢測。

5. 其它生物樣品：1000×g離心20分鐘，取上清即可檢測

6. 樣品應清澈透明，懸浮物應離心去除。

7. 樣品收集后若在1周內進行檢測的可保存于4℃，若不能及時檢測，請按一次使用量分裝，凍存于-20℃(1個月內檢測)，或-80℃（6個月內檢測），避免反復凍融。

8. 如果您的樣品中檢測物濃度高于標準品*高值，請根據(jù)實際情況，做適當倍數(shù)稀釋（建議先做預實驗，以確定稀釋倍數(shù)）。

試驗所需自備物品:

1. 酶標儀(450nm波長濾光片)

2. 高精度移液器，EP管及一次性吸頭：0.5-10μL, 2-20μL, 20-200μL, 200-1000μL

3. 37℃恒溫箱，雙蒸水或去離子水

4. 吸水紙

馬Ⅱ型前膠原氨基端原肽(PⅡNT)檢測試劑盒檢測前準備工作:

1. 請?zhí)崆?0分鐘從冰箱中取出試劑盒，平衡至室溫。

2. 將濃縮洗滌液用雙蒸水稀釋(1:25)。未用完的放回4℃。從冰箱中取出的濃縮洗滌液可能有結晶，屬于正常現(xiàn)象，可用40℃水浴微加熱使結晶完全溶解后再配制洗滌液（加熱溫度不要超過50℃，使用時洗滌液應為室溫）。當日使用。

3. 標準品: 于10000×g離心1分鐘，加入標準品&樣品稀釋液1.0mL至凍干標準品中，旋緊管蓋，靜置10分鐘，上下顛倒數(shù)次，待其充分溶解后，用移液器將其輕輕混勻（濃度為200ng/mL。）。然后根據(jù)需要進行倍比稀釋（注：不要直接在反應孔中進行倍比稀釋）。建議配制成以下濃度：按照稀釋方法圖例 標準品&樣品稀釋液直接作為空白孔0ng/mL。如配制5ng/mL標準品：取0.5mL10ng/mL的上述標準品加入含有0.5mL標準品&樣品稀釋液的EP管中，混勻即可，其余濃度依此類推。  

4. 生物素化抗體工作液：實驗前計算當次實驗所需用量（以100μL/孔計），實際配制時應多配制100-200μL。使用前15分鐘，以生物素化抗體稀釋液稀釋濃縮生物素化抗體(1:100)成工作濃度。當日使用。

5. 酶結合物工作液：實驗前計算當次實驗所需用量（以100μL/孔計），實際配制時應多配制100-200μL。使用前15分鐘，以酶結合物稀釋液稀釋濃縮HRP酶結合物(1:100)成工作濃度。

當日使用。

標準品稀釋方法圖例：（以500μL/管為例，也可根據(jù)實際用量來稀釋，如200μL/管）

 洗滌方法:

任何一個成功的ELISA檢測，正確的洗板方法是非常關鍵和重要的一方面。連貫的洗板也很有必要的。在稀釋濃縮洗滌液時，請使用去離子水或者蒸餾水。

◆ 洗滌瓶或多通道移液器

保證洗瓶內壓強良好或者移液器的管頭被適當調整并且無碎屑。檢查板內的板條是否安好。將板條編號以防在傾泄的時候松動便于調整。首先，傾泄酶標板以清空內容物。根據(jù)試劑盒內推薦的體積向每孔內滴加洗液。若實驗步驟中要求浸泡，則定時將每孔浸泡完全。將板內液體傾倒完全，用干凈紙巾擦拭。按照說明書所示重復以上步驟。*后一次洗板之后，將板內液體傾倒完全，用干凈紙巾拍打表面并擦干。切勿讓孔內干燥。按照試劑盒內說明書迅速進行下一步實驗操作。

◆ 自動洗板儀

將自動洗板儀接入適當真空（根據(jù)制造商的說明）。確保每管都被適當抽吸。首先，通過吸或者傾倒將板清空。根據(jù)試劑盒內推薦的體積向每孔內滴加洗液。若實驗步驟中要求浸泡，則定時將每孔浸泡完全。完全抽吸各孔，保證沒有洗液殘留。在孔內液體被完全抽走之后不要再將裝置至于孔內過分抽吸。按照說明書所示重復以上步驟。*后一次洗板之后，將板內液體傾倒完全，用干凈紙巾拍打表面并擦干。切勿讓孔內干燥。按照試劑盒內說明書迅速進行下一步實驗操作。

操作步驟:

實驗開始前，各試劑均應平衡至室溫；試劑或樣品配制時，均需充分混勻，并盡量避免起泡。

1. 加樣：分別設空白孔、標準孔、待測樣品孔。空白孔加標準品&樣品稀釋液 100μL，余孔分別加標準品或待測樣品 100μL，注意不要有氣泡，加樣時將樣品加于酶標板底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻。給酶標板覆膜，37℃孵育 90 分鐘。為保證實驗結果有效性，每次實驗請使用新的標準品溶液。

2. 棄去液體，甩干，不用洗滌。每個孔中加入生物素化抗體工作液 100μL（在使用前15 分鐘內配制），酶標板加上覆膜，37℃溫育 1 小時。

3. 棄去孔內液體，甩干，洗板 3 次，每次浸泡 1-2 分鐘，大約 350μL/每孔，甩干并在吸水紙上輕拍將孔內液體拍干。

4. 每孔加酶結合物工作液（臨用前 15 分鐘內配制）100μL，加上覆膜，37℃溫育30 分鐘。

5. 棄去孔內液體，甩干，洗板5 次，方法同步驟3。

6. 每孔加底物溶液(TMB)90μL，酶標板加上覆膜37℃避光孵育15 分鐘左右（根據(jù)實際顯**況酌情縮短或延長，但不可超過30 分鐘。當標準孔出現(xiàn)明顯梯度時，即可終止）。

7. 每孔加終止液 50μL，終止反應，此時藍色立轉黃色。終止液的加入順序應盡量與底物溶液的加入順序相同。

8. 立即用酶標儀在 450nm 波長測量各孔的光密度（OD 值）。應提前打開酶標儀電源，預熱儀器，設置好檢測程序。

9. 實驗完畢后將未用完的試劑按規(guī)定的保存溫度放回冰箱保存。

馬Ⅱ型前膠原氨基端原肽(PⅡNT)檢測試劑盒注意事項：

◆ 仔細閱讀說明書。

◆ 檢查試劑盒標簽上的有效期。如果超過有效期，請勿使用。

◆ 按說明書確定所有試劑齊全（數(shù)量、體積）。

◆ 標本制備要規(guī)范，每份標本體積要按2-3個復孔以上的量制備（貯存），盡量分裝做備份。短期內無法實驗者，注意低溫保存。

◆ 準備好所有實驗額外所需物品，（比如移液器，試管，清洗器，酶標儀）。

◆ 按說明書將所用試劑平衡至室溫，根據(jù)檢測標本數(shù)量確定所需試劑的量。

◆ 檢查試劑盒內每種試劑的貯存條件，保證所有試劑均按照試劑盒內說明書推薦的條件存儲。

◆ 檢查不穩(wěn)定或者變質的試劑溶液（比如沉淀或變色）。有些試劑，比如標準品稀釋液或者檢測稀釋液，可能在設計時就含有沉淀物。所有試劑在滴入酶標板之前，必需充分混勻。而由于沉淀物的特性，在加入酶標板之前，必需不停攪拌。

◆ 保證充分的孵育時間和溫度。

◆ 切勿使用不同生產(chǎn)批號的試劑取代現(xiàn)有試劑或混合現(xiàn)有試劑。

◆ 在混合或溶解蛋白溶液時，避免泡沫產(chǎn)生。

◆ 在實驗開始之前，安排好實驗流程。

◆ 在實驗開始之前，清潔工作臺。

◆ 若有問題，應與我公司或代理商的技術支持聯(lián)系  

結果判斷:

1. 每個標準品的OD值減去空白孔的OD值后作圖，如設置復孔，則應取其平均值計算。以標準品的濃度為橫坐標，OD值為縱坐標，繪出標準曲線。亦可以OD值為橫坐標，標準品的濃度為縱坐標，繪出標準曲線。

2. 推薦使用專業(yè)的曲線制作軟件，如curve expert 1.3或1.4，在軟件界面既可根據(jù)樣品OD值，由標準曲線查出相應的濃度，乘以稀釋倍數(shù)；亦可將樣品的OD值代入標準曲線的擬合方程式，計算出樣品濃度，再乘以稀釋倍數(shù)，即為樣品的實際濃度。

3. 若樣品OD值高于標準曲線上限，應適當稀釋后重測，計算濃度時應乘以稀釋倍數(shù)。

馬Ⅱ型前膠原氨基端原肽(PⅡNT)檢測試劑盒靈敏度、檢測范圍、特異性和重復性:

●靈敏度：*小可測：1.34ng/mL

●檢測范圍：3.125-200ng/mL

● 重復性：板內，板間變異系數(shù)均<10%。

● 特異性:可檢測重組或天然的馬Ⅱ型前膠原氨基端原肽(PⅡNT)，且與其它相關蛋白無交叉反應。

操作概要

1. 在各孔中加入標準品或樣品各 100μL， 37℃孵育 90 分鐘

2. 倒去孔內液體，加入 100μL 生物素化抗體工作液，37℃孵育 60 分鐘

3. 洗滌 3 次

4. 加入 100μL 酶結合物工作液， 37℃孵育 30 分鐘

5. 洗滌 5 次

6. 加入 90μL 底物溶液， 37℃孵育 15 分鐘左右

7. 加入 50μL 終止液，立即在 450nm 波長處測量 OD 值

8. 結果計算  

問題分析

若實驗效果不好，請及時對顯色結果拍照，保留所用板條及未使用試劑，并妥善保存，然后

聯(lián)系我公司技術支持為您解決問題。

我是按照實驗步驟進行測定的，但是沒有任何信號，為什么？

◆ 對于使用HRP底物的比色測定，終止液的加入會使底物變色。而說明書推薦的波長就是*適波長。

◆ 通過輕拍酶標板的邊緣充分混合孔內試劑。加入終止液的時，顏色由藍變黃（如果是HRP

底物）。如果加終止液之前孔內試劑沒有混合，則底物顏色變綠。

◆ 可能加入試劑的順序錯誤。

◆ 加入底物溶液以后不要清洗酶標板。

◆ 在連續(xù)稀釋時確定已經(jīng)加入標準品。

◆ 如果底物系統(tǒng)中有兩個成分，則必需混合均勻。

◆ 確定酶標儀的使用和操作正確。

◆ 確定試劑，標準品，樣品都正確配制并按照說明滴加無誤。

◆ 對于高敏感性試劑盒，確定使用的底物和放大劑都正確稀釋。