丙二醛（MDA）是常用的膜脂過(guò)氧化指標(biāo)，在酸性和高溫度條件下，可以與硫代***酸（TBA）反應(yīng)生成紅棕色的**川（3,5,5-**基惡唑2,4-二酮），其*大吸收波長(zhǎng)在532nm。但是測(cè)定植物組織中MDA時(shí)受多種物質(zhì)的干擾，其中*主要的是可溶性糖，糖與TBA顯色反應(yīng)產(chǎn)物的*大吸收波長(zhǎng)在450nm，532nm處也有吸收。植物遭受干旱、高溫、低溫等逆境脅迫時(shí)可溶性糖增加，因此測(cè)定植物組織中MDA—TBA反應(yīng)物質(zhì)含量時(shí)一定要排除可溶性糖的干擾。低濃度的鐵離子能夠顯著增加TBA與蔗糖或MDA顯色反應(yīng)物在532、450nm處的消光度值，所以在蔗糖、MDA與TBA顯色反應(yīng)中需一定量的鐵離子，通常植物組織中鐵離子的含量為100～300μg/g DW，根據(jù)植物樣品量和提取液的體積，加入Fe3＋的終濃度為0.5μmol/L。
 

A. 直線回歸法

    MDA與TBA顯色反應(yīng)產(chǎn)物在450nm波長(zhǎng)下的消光度值為零。不同濃度的蔗糖（0～25mmol/L）與TBA顯色反應(yīng)產(chǎn)物在450nm的消光度值與532nm和600nm處的消光度值之差成正相關(guān)，配制一系列濃度的蔗糖與TBA顯色反應(yīng)后，測(cè)定上述三個(gè)波長(zhǎng)的消光度值，求其直線方程，可求算糖分在532nm處的消光度值。UV-120型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)的直線方程為：

Y532＝﹣0.00198＋0.088D450      ① 
                                   

B．雙組分分光光度計(jì)法

據(jù)朗伯-比爾定律：D＝kCL，當(dāng)液層厚度為1cm時(shí)，k=D/C，k稱為該物質(zhì)的比吸收系數(shù)。當(dāng)某一溶液中有數(shù)種吸光物質(zhì)時(shí)，某一波長(zhǎng)下的消光度值等于此混合液在該波長(zhǎng)下各顯色物質(zhì)的消光度之和。
 

    已知蔗糖與TBA顯色反應(yīng)產(chǎn)物在450nm和532nm波長(zhǎng)下的比吸收系數(shù)分別為85.40，7.40。MDA在450nm波長(zhǎng)下無(wú)吸收，故該波長(zhǎng)的比吸收系數(shù)為0，532nm波長(zhǎng)下的比吸收系數(shù)為155，根據(jù)雙組分分光度計(jì)法建立方程組，求解方程得計(jì)算公式：

C1(mmol/L)=11.71D450                                      ②

C2(μmol/L)=6.45(D532－D600)－0.56D450         ③

式中  C1－為可溶性糖的濃度；

C2－為MDA的濃度；

D450、D532、D600分別代表450nm、532nm和600nm波長(zhǎng)下的消光度值。

    1. 實(shí)驗(yàn)材料  受干旱、高溫、低溫等逆境脅迫的植物葉片或衰老的植物器官。
 

    2. MDA的提取  稱取剪碎的試材1g，加入2ml 10％TCA和少量石英砂，研磨至勻漿，再加8ml TCA進(jìn)一步研磨，勻漿離心（4000×g）10min，上清液為樣品提取液。
 

    3. 顯色反應(yīng)和測(cè)定  吸取離心的上清液2ml（對(duì)照加2ml蒸餾水），加入2ml 0.6%TBA溶液，混勻物于沸水浴上反應(yīng)15min，迅速冷卻后再離心。取上清液測(cè)定532nm、600nm和450nm波長(zhǎng)下的消光度。
 

    4. 計(jì)算含量

    (1) 直線方程法  按公式①求出樣品中糖分在532nm處的消光度值Y532，用實(shí)測(cè)532nm的消光度值減去600nm非特異吸收的消光度值再減去Y532，其差值為測(cè)定樣品中MDA-TBA反應(yīng)產(chǎn)物在532nm的消光度值。按MDA在532nm處的毫摩爾消光系數(shù)為155換算求出提取液中MDA濃度。
 

    (2) 雙組分分光光度法  按公式③可直接求得植物樣品提取液中MDA的濃度。

    用上述任一方法求得MDA的濃度，根據(jù)植物組織的重量計(jì)算測(cè)定樣品中MDA的含量：
 MDA（μmol/g FW）＝ (MDA濃度(umol/L)*提取液體積(ml))) / 植物組織鮮重(g)

1. 0.1-0.5%的三***對(duì)MDA—TBA反應(yīng)較合適,若高于此濃度,其反應(yīng)液的非專一性吸收偏高;
 

2. MDA-TBA顯色反應(yīng)的加熱時(shí)間,*好控制沸水浴10-15min之間.時(shí)間太短或太長(zhǎng)均會(huì)引起532nm下的光吸收值下降; 
 

3. 如待測(cè)液渾濁,可適當(dāng)增加離心力及時(shí)間,*好使用低溫離心機(jī)離心.
 

4. 低濃度的鐵離子能增強(qiáng)MDA與TBA的顯色反應(yīng),當(dāng)植物組織中鐵離子濃度過(guò)低時(shí)應(yīng)補(bǔ)充 Fe3 (*終濃度為0.5 nmol·L-1)
 

5. 可溶性糖與TBA顯色反應(yīng)的產(chǎn)物在532 nm也有吸收(*大吸收在450 nm),當(dāng)植物處于干旱,高溫,低溫等逆境時(shí)可溶性糖含量會(huì)增高,必要時(shí)要排除可溶性糖的干擾.