ELISA試劑盒技術流程

雙抗體夾心法(檢測未知抗原)

1、用緩沖液將抗體稀釋至1-10ug/ml。在反應孔中加0.1ml，4℃ 過夜。次日，棄去孔內溶液，用洗滌緩沖液洗3次。

2、加樣：加一定稀釋的待檢樣品0.05ml于上述已包被之反應孔中，置37℃ 孵育1小時。然后洗滌(同時做空白孔，陰性對照孔及陽性對照孔)。

3、加酶標抗體：于各反應孔中，加入新鮮稀釋的酶標抗體(經滴定后的稀釋度)0.05ml。37℃ 孵育0.5～1小時，洗滌。

4、加底物液顯色：于各反應孔中加入臨時配制的TMB底物溶液0.1ml，37℃ 10～30分鐘。

5、終止反應：于各反應孔中加入2M硫酸0.05ml

6、結果判定：可于白色背景上，直接用肉眼觀察結果：反應孔內顏色越深，陽性程度越強，陰性反應為無色或極淺，依據所呈顏色的深淺，以“+”、“-”號表示。也可測OD值：在ELISA檢測儀上，于450nm(若以ABTS顯色，則410nm)處，以空白對照孔調零后測各孔OD值，若大于規定的陰性對照OD值的2.1倍，即為陽性。

間接法(檢測未知抗體)

1、用包被緩沖液將已知抗原稀釋至1-10ug/ml， 每孔加0.1ml，4℃過夜。次日洗滌3次。

2、加樣：加一定稀釋的待檢樣品(未知抗體)0.05ml于上述已包被之反應孔中,置37℃孵育1小時,洗滌。(同時做空白、陰性及陽性孔對照)

3、加酶標抗體：于反應孔中，加入新鮮稀釋的酶標**抗體(抗抗體)0.05ml，37℃孵育30-60分鐘，洗滌,*后一遍用DDW洗滌。

4、加底物液顯色：于各反應孔中加入臨時配制的TMB底物溶液0.1ml，37℃ 10～30分鐘。

5、終止反應：于各反應孔中加入2M硫酸0.05ml

6、結果判定：可于白色背景上，直接用肉眼觀察結果：反應孔內顏色越深，陽性程度越強，陰性反應為無色或極淺，依據所呈顏色的深淺，以“+”、“-”號表示。也可測OD值：在ELISA檢測儀上，于450nm(若以ABTS顯色，則410nm)處，以空白對照孔調零后測各孔OD值，若大于規定的陰性對照OD值的2.1倍，即為陽性。